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本试剂盒采用加A法来进行miRNA第一链cDNA的反转录。具体过程是先通过E.coli Poly(A) Polymerase在miRNA 3′末端加多聚A尾Poly(A)，再使用Oligo(dT)-Universal Tag通用逆转录引物进行逆转录反应，最终生成miRNA对应的cDNA第一链。

本试剂盒采用了双组分形式，简化了实验操作流程，降低了操作失误的可能性。本产品中的miRNA RT Enzyme Mix包含了E.coli Poly(A)Polymerase、RTase和RNasin。其中的E.coli Poly(A) Polymerase不但具有高效的加A尾效率，还可特异性识别单链miRNA，从而避免了具有双链结构的miRNA前体的进一步逆转录反应；RTase经过分子改造，去掉了RNase H活性，增加了RNA模板亲和力，从而使得miRNA的逆转录反应具有更高的效率和灵敏度。

本试剂盒中的2×miRNA RT Reaction Buffer包含了miRNA加A尾反应和逆转录反应的所有原料和引物，并经过精心优化，可保证miRNA 3′末端的Poly(A)修饰过程和逆转录过程同时高效进行。

• 省时省力：本试剂盒将miRAN的加A尾反应和逆转录反应合二为一，在减少操作步骤的同时也节省了一半的反应时间。另外，本试剂盒为双组分形式，操作过程中只需加入RNA模板和两个组分即可进行miRNA的逆转录反应，进一步简化了操作。
  
• 特异性强：本试剂盒中的E.coli Poly(A) Polymerase和RTase都只针对单链的miRNA进行修饰和逆转录反应，因此可最大程度的避免具有二级结构的miRNA前体进行逆转录反应。
  
• 灵敏度高：本试剂盒通过将加A尾反应和逆转录反应的整合实现了miRNA的加A产物可全部进行进一步的逆转录反应，大大提高了低丰度miRNA的检出率。
  
• 适用广泛：本试剂盒可针对几乎所有材料提取的miRNA进行逆转录反应，模板的使用范围可达20pg～2μg(质量范围)和10fM～100pM(浓度范围)。

组分	20μL×25次	20μL×50次
miRNA RT Enzyme Mix	50μL	100μL
2×miRNA RT Reaction Buffer	250μL	500μL
RNase-Free ddH2O	1mL	1mL

保存：-20℃，有效期一年。

• 本试剂盒须与miRNA荧光定量检测试剂盒(WH0132)配套使用。
  
• 本试剂盒从-20℃取出使用时，将miRNA RT EnzymeMix需放在冰中备用；将冻存的2×miRNA RT Reaction Buffer融解，融解后轻轻颠倒混匀，待溶液完全均一后再行使用。
  
• 预防RNase污染，应注意以下几方面：
  
  • 经常更换新手套。因为皮肤经常带有细菌，可能导致RNase污染。
    
  • 使用无RNase的塑料制品和枪头避免交叉污染。
    
  • RNA在裂解液中不会被RNase降解。但提取后继续处理过程中应使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150℃烘烤4h，塑料器皿可在0.5M NaOH中浸泡10min，然后用水彻底清洗，再灭菌，即可去除RNase。
    
  • 配制溶液应使用无RNase的水(将水加入到干净的玻璃瓶中，加入DEPC至终浓度0.1% (v/v)，放置过夜，高压灭菌)。

一、反转录体系的配制
解冻2×miRNA RT Reaction Buffer并混匀，miRNA RT Enzyme Mix放于冰中备用，在冰上预冷RNase Free的反应管内加入以下试剂至总体积20μL (最后加入miRNA RT Enzyme Mix)。

组分	使用量	终浓度
Total RNA*	可达2μg	-
2×miRNA RT Reaction Buffer	10μL	1×
miRNA RT Enzyme Mix	2μL	-
RNase-Free ddH2O	补至20μL	-

注^*：反应中所使用的Total RNA必须含有小分子RNA。此过程也可以使用小分子RNA作为模板，建议加入量为2～5μL。可根据目的miRNA丰度决定加入量，但是对于低丰度miRNA样品而言(如血清血浆提取物)，可直接加入最大体积8μL。

二、反转录程序
移液器轻轻混匀上述配制的反应液，按下表程序进行miRNA的逆转录反应：

反应温度	反应时间	说明
42℃	60min	miRNA加A尾反应和逆转录反应
95℃	3min	酶失活反应

合成的cDNA反应液可放置于-20℃保存；也可以直接进行下游荧光定量检测。在进行下游荧光定量检测时，为避免逆转录体系对定量PCR反应的抑制，得到最适的Ct值(15～30之间)，可将cDNA反应液稀释10～1000倍后使用。
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